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北京大學(xué)工學(xué)院席鵬課題組與合作者在活細(xì)胞超分辨成像領(lǐng)域做出新突破，翻開了活細(xì)胞線粒體STED（Stimulated Emission Depletion Microscopy）長時(shí)程觀察的新篇章。該工作開發(fā)了一種新型線粒體染料MitoESq-635，其飽和光強(qiáng)相較于傳統(tǒng)的ATTO 647N降低3.4倍，有利于長時(shí)間STED超分辨成像。利用這一優(yōu)勢，該工作實(shí)現(xiàn)了對活細(xì)胞線粒體長達(dá)50分鐘的活細(xì)胞動態(tài)觀測，達(dá)到了35.2納米的超高分辨率，觀測到了線粒體聚合以及分裂的動態(tài)過程。該成果于7月24日在線發(fā)表在Nature子刊《自然·通訊》(Nature Communications)上。

線粒體是細(xì)胞的“發(fā)電廠”，其內(nèi)部具有豐富的線粒體嵴用于ATP合成。由于它具有自己獨(dú)立的DNA，其也經(jīng)常被認(rèn)為是遠(yuǎn)古細(xì)菌入侵細(xì)胞并形成共生關(guān)系的一種典范。同時(shí)，在癌癥等疾病中，由于新陳代謝異常，線粒體嵴也呈現(xiàn)異常。然而，受到衍射極限的影響，傳統(tǒng)顯微鏡只有300nm左右的分辨率，無法觀測線粒體嵴這類細(xì)微結(jié)構(gòu)。STED超分辨技術(shù)因其超高分辨率和較快的成像速度，適用于研究線粒體嵴結(jié)構(gòu)。但是STED技術(shù)通常需要較高的光強(qiáng)實(shí)現(xiàn)超分辨，對于線粒體的毒性極高，且普通染料很容易被光漂白。該項(xiàng)目所研發(fā)的新型線粒體染料MitoESq-635有較低的飽和功率，實(shí)現(xiàn)相同的分辨率只需要相對更低的STED光強(qiáng)，降低了光漂白的效果；同時(shí)有較高的穩(wěn)定性，能夠長時(shí)間照射仍保有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。共定位結(jié)果顯示該染料能特異性標(biāo)記線粒體。這些特性使得它成為活細(xì)胞線粒體長時(shí)間STED超分辨成像的最佳染料之一。

活細(xì)胞線粒體STED長時(shí)程成像。（a）線粒體動態(tài)成像結(jié)果；（b）共聚焦和STED對比；（c）強(qiáng)度分布展現(xiàn)了35.2納米分辨率

利用這一染料結(jié)合STED超分辨技術(shù)，該工作實(shí)現(xiàn)了三維切片STED成像，提供了豐富的線粒體三維立體信息。該技術(shù)的動態(tài)超分辨的觀測能力，推動了對線粒體動態(tài)過程的定量分析。隨著拍攝時(shí)間的增加，線粒體的寬度會逐漸變大，熒光強(qiáng)度會緩慢下降，圖像分辨率也會下降。通過合理地定量分析找到了合適的STED照射光強(qiáng)，平衡了分辨率、信噪比、拍攝時(shí)間等幾個(gè)方面的參數(shù)。

該項(xiàng)目清晰地觀察到了線粒體聚合以及分離的過程，對比與普通共聚焦顯微鏡，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了35.2納米的超高分辨率，清晰地看到了線粒體嵴的動態(tài)變化。同時(shí)觀察到了線粒體聚合在一起，以及分離開來的動態(tài)過程，對線粒體形態(tài)學(xué)和功能變化的研究有著重要意義。對比電子顯微鏡的圖片，該項(xiàng)目在動態(tài)成像的基礎(chǔ)上觀察到了類似的線粒體結(jié)構(gòu)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了該技術(shù)的超高分辨能力。

北京大學(xué)席鵬教授提到：成像技術(shù)的發(fā)展目標(biāo)不外乎“清”，“快”，“深”，“活”（“輕快生活”）四個(gè)字，本項(xiàng)目正是在這四字方針的指導(dǎo)下，向“清晰”，“快速”，“深層”，“活體”這四個(gè)方面研究突破，實(shí)現(xiàn)了35.2納米的超高空間分辨率，同時(shí)可以達(dá)到0.66秒每幀的較高時(shí)間分辨率，較深的三維切片成像，以及長達(dá)50多分鐘的活細(xì)胞動態(tài)成像。

該工作的共同第一作者楊旭三是北京大學(xué)工學(xué)院畢業(yè)博士生（導(dǎo)師席鵬），目前在康奈爾大學(xué)進(jìn)行博士后研究，共同第一作者楊志剛是深圳大學(xué)光電工程學(xué)院教授，共同一作吳朝陽是北京大學(xué)工學(xué)院博士生（導(dǎo)師席鵬）。共同通訊作者分別為：席鵬，屈軍樂（深圳大學(xué)），楊志剛（深圳大學(xué)，共同一作），楊旭三（共同一作）。

席鵬課題組近年來致力于超分辨技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，如：

1) 綜合利用上轉(zhuǎn)換納米探針的光子雪崩和交叉馳豫特性，實(shí)現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換低功率STED，將飽和光強(qiáng)降低兩個(gè)數(shù)量級以上(Nature 2017)；

2) 利用反射駐波光場調(diào)控成功實(shí)現(xiàn)19 nm的STED超分辨成像，達(dá)到目前STED生物樣品成像分辨率的最高紀(jì)錄，并對細(xì)胞核孔和病毒絲進(jìn)行成像 (Light 2016)；

3) 利用高斯-貝塞爾光場調(diào)控，將STED成像的軸向深度提升一個(gè)數(shù)量級(Laser Photonics Review 2016)；

4) 結(jié)合偏振與結(jié)構(gòu)光實(shí)現(xiàn)熒光偶極子超分辨成像(Light 2016，Nature Communications 2019)，并兩次得到Nature Methods的研究亮點(diǎn)評價(jià)。這些工作為本工作奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。